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科研中的“新星”技术

技术文章:科研中的“新星”技术 添加时间:2018-3-4 23:21:36

为检验BioTeke公司实时荧光定量试剂(SYBR GreenⅠ)质量,本次实验分别采用国际知名的ABI公司(ABI Power SYBR Green PCR Master Mix)、TOYOBO公司(Realtime SYBR GreenⅠPCR Master Mix)和BioTeke公司产品进行实时荧光定量PCR分析,实验过程中除了荧光定量试剂Mix不同,其它反应条件(模板、引物和反应体系等)均一致,所用荧光定量PCR仪型号为ABI7000。
实验材料
小鼠肝脏组织
实验方法
RNA提取:RNApure高纯总RNA提取试剂盒(BioTeke),操作步骤参照说明书。目的基因:小鼠管家基因β–actin.。
cDNA制备:测定小鼠肝脏总RNA浓度,而后使用Super RT Kit(BioTeke) 制备20μl cDNA。操作参照试剂盒说明书。
二步法荧光定量PCR:
BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit. 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
ABI Power SYBR Green PCR Master Mix Kit 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
TOYOBO Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) Kit 20μl反应体系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl

备注:每份试剂均做三管重复。

反应程序:
95℃ 10min
95℃ 15sec
61℃ 31sec
40个循环