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钙离子检测荧光探针专题

产品专题:钙离子检测荧光探针专题 添加时间:2018-3-4 23:45:25

产品描述

钙离子浓度变化是活细胞接受外界刺激后产生级联反应的重要信息传递方式,因此细胞内钙离子检测是信号转导G蛋白偶联受体(GPCR)介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段,该领域中常使用钙离子荧光探针与钙离子的特异性结合来观察细胞内钙离子浓度水平的变化,此类探针未结合Ca2+前几乎无荧光,结合Ca2+后,荧光强度显著增强,所显示光谱可被荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱法以及荧光酶标仪等多种方法检测。

常用的Ca2+荧光探针根据波长的不同,分为两大类:

第一类:可见光激发Ca2+荧光探针

与紫外光激发的荧光探针相比,如Fura-2和Indo-1,可见光激发Ca2+探针具有以下特点:

1)适用于大多数的激光共聚焦测钙系统,包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

2)具有更强的染料吸收性能,使得更低浓度的探针即可成功检测Ca2+变化,从而降低了对活细胞的光毒性。

3)Ca2+依赖性荧光强度增强,对Ca2+变化水平检测敏感度更高。

4)降低样品自荧光以及光散射的干扰。

5)兼容光激活探针以及UV-激发试剂,因此更方便于多参数检测。5)无光谱偏移。

介绍几种最受欢迎的可见光激发Ca2+荧光探针:

1Fluo-3

Fluo-3是最常用的可见光激发Ca2+荧光探针,较高的Ca2+结合力可捕捉细胞内Ca2+信号的动力学变化,使用于多种流式细胞术相关实验,如笼锁Ca2+螯合剂光活化、第二信使、神经传导物质研究以及细胞水平的药物筛选等。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的,其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是,当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光,荧光会增加60至100倍,最大激发波长为 506nm,最大发射波长为 526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右,发射波长为525~530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

2Fluo-4

Fluo-4是钙指示剂Fluo-3的升级版本,主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4上的氟所取代,该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快,在相同浓度下检测信号更强。

3Rhod-2

Rhod-2是另一种可见光激发的高亲和力Ca2+指示剂,与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比,Rhod-2具有长波长,更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁Ca2+螯合剂光激活导致的钙离子释放。

图 Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 µM free Ca2+.

你所不知道的秘密:为什么许多荧光探针会有R-AM或者R的形式提供?以Fluo-4Fluo-4, AM为例。

常规的荧光探针如Fluo-4属极性大的酸性化合物,无法进入细胞内。此时,若想做细胞内染色,需要通过膜片微电极(patch pipette),显微注射(microinjection),胞引作用加载试剂等手段,辅助实现药物加载,何其麻烦!!

 

 

为此,而通过在Fluo-4的负性基团上结合乙酰氧甲酯(AM,该单一的变化既增加了酯溶性又消除了负电荷,极大的提高了细胞渗透性。只需要把细胞孵育在含药物的培养液中,即可实现加载,非常省事。而一旦Fluo-4 AM进入细胞后,酯化钙离子荧光探针被酯酶水解,恢复Fluo-4,在胞内完全发挥其正常生理功能。